用户文章：Nature子刊——lncRNA形成circRNA翻译功能性多肽

论文标题：A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma

刊登日期：2018年10月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：17.694

研究机构：中山大学附属第一医院张弩研究团队

技术手段：circRNA测序

研究背景

LINC-PINT目前已有文献报道以作为胰腺癌的标志物，抑制肺癌和结直肠癌生长，具有抑制细胞增殖的作用。Circular RNA (CircRNA)作为哺乳动物基因组中一大类转录本，尽管已有报道表明一些circRNA具有编码功能，但其翻译产物的功能仍不明确。

主要研究内容

1. 潜在的编码circRNA的高通量测序

图1 在正常及癌细胞中进行转录组学和翻译组学分析筛选潜在的编码circRNA

首先，作者对正常脑细胞和脑胶质瘤细胞进行circRNA测序和翻译组测序，通过两组学联合分析发现大部分circRNA从外显子编码区（CDS）产生，也有部分circRNAs产生于反义链或内含子区域，大多数circRNAs长度少于1500个核苷酸。经过数据分析初步确定了LINC-PINT(ENSG00000231721)用于进一步研究。LINC-PINT是抑癌长非编RNA，主要与Polycomb repressive complex 2(PRC2)相互作用，但目前没有证据表明LINC-PINT为编码RNA。

2. 鉴定由LINC-PINT 的外显子2形成的circRNA

图2 将 LINC-PINT 的外显子 2 鉴定为 circRNA

作者通过ISH、qPCR、sanger测序和Northern blot分析后，发现LINC-PINT 和circPINTexon2在神经干细胞和293T中均有表达，但在不同的神经胶质瘤和脑瘤肿瘤起始干细胞（BTIC）细胞系中表达下调。LINC-PINT 和circPINTexon2存在不同的细胞定位，LINC-PINT主要位于细胞核，但circPINTexon2主要位于细胞质。

3. CircPINTexon2 编码一个肽

图3 circPINTexon2 编码一个 87-aa 肽

为了检验 circPINTexon2 是可翻译的假设，作者首先分析了 LINC-PINT 外显子 2 中所有推定的 sORF。在该外显子中鉴定到两个sORF，可能编码长度为69 aa和87 aa的肽，在多个物种中高度保守。通过生物信息学分析和 IRES 活性测试，发现只有87aa肽能够表达。circPINTexon2包含一个内部核糖体进入位点（IRES），作者通过构建circRNA双荧光的报告质粒确定了IRES位置，并通过IP结合LC-MS/MS进一步确定了87aa sORF的存在。随后作者设计了circRNA和lncRNA干扰片段，通过转染293T发现干扰lncRNA不影响circRNA的表达，进一步表明87aa为circRNA编码的蛋白。

4. PINT87aa的体外肿瘤抑制作用

图4 PINT87aa 在细胞和人体组织中的定位和表达

图5 PINT87aa的生物学功能

下一步，作者通过细胞实验证明了PINT87aa主要定位于细胞核，并可能参与细胞调控。circPINTexon2 和PINT87aa主要在脑、肝、肾、胃中表达，在乳腺、肠、甲状腺、胰腺表达量较低。因为PINT87aa在脑中的高表达，作者检测了胶质瘤和BTIC细胞系的表达情况。并通过CRISPR/Cas9构建SW1783 和Hs683细胞系。

通过在细胞中过表达PINT87aa，发现其具有抑制细胞增殖的作用，并使克隆形成降低，细胞周期G1期阻滞，表明PINT87aa具有抑制肿瘤生长的作用。并可以提高IR敏感性。综合分析circPINTexon2的肿瘤抑制作用主要是通过PINT87aa而不是circPINTexon2。

5. PINT87aa调节多个癌基因的RNA延伸

图6 PINT87aa 直接与 PAF1 复合物相互作用并抑制 mRNA 转录延伸

图7 PINT87aa 决定 PAF1 复合物在靶基因启动子上的定位

为了进一步探索 PINT87aa 肿瘤抑制功能的潜在分子机制，我们首先检查了一些在 PINT87aa 过表达的 BTIC 中对胶质瘤肿瘤发生至关重要的原癌基因。作者构建了flag标签融合蛋白后，通过免疫共沉淀结合质谱确定与PINT87aa相互作用的蛋白PAF1，GFP-PINT87aa 和PAF1共定位都位于细胞核，并检测PAF1调控的潜在的靶基因，发现表达PINT87aa后CPEB1，SOX2，C-MYC等转录水平受到抑制。通过Chip结合qPCR分析，发现PINT87aa可改变PAF1复合物与靶基因的相互作用，PINT87aa过表达或敲除可增加或降低PAF1/CPEB1的亲和作用。

6.PINT87aa的抑癌作用

图8 circPINTexon2 和 PINT87aa 的临床意义

为了了解 PINT87aa 的潜在临床意义，作者检测了人类胶质瘤样本和配对的相邻正常组织中 circPINTexon2 和 PINT87aa 的表达。结果发现RNA circ-PINT以及翻译的87aa蛋白在正常组织中高表达，肿瘤中低表达。裸鼠体内成瘤实验表明，PINT87aa的高表达成瘤能力减弱，使动物的生存期延长。与亲代细胞相比，PINT87aa K.O.细胞导致异种移植肿瘤体积显着增加，进一步支持了 PINT87aa 肽在体内的抗癌作用。

总结

研究者通过circRNA测序、翻译组测序以及生物信息学分析，发现了长非编码RNA LINC-PINT的第2外显子通过单独自身环化形成了环状的RNA分子Circ-PINT，环化后的RNA分子定位于细胞质，而全长LINC-PINT母基因定位在细胞核；通过对Circ-PINT进行预测分析，发现环状RNA序列中包含一个进化上高度保守的开放阅读框，制备特异性抗体和CRISPR/cas9基因敲除细胞株，证实环状RNA circ-PINT通过内部核糖体插入位点序列IRES驱动翻译一个由87个氨基酸组成的全新多肽。研究结果显示PINT87aa多肽在肿瘤中显著下调，提示其作为一个抑癌基因的可能性。机制研究发现PINT87aa通过结合聚合酶相关因子复合物基因PAF1，抑制多种癌基因的转录延伸，进而抑制恶性胶质瘤的发生和进展。

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